Administration intrathécale d’un composé d’essai dans le système nerveux central du rat

Résumé

Source : Chen, Y., et al. Administration intrathécale d’oligonucléotides antisens dans le système nerveux central du rat. J. Vis. Exp. (2019)

Cette vidéo montre l’administration d’un composé d’essai dans le liquide céphalo-rachidien (LCR) par le biais d’un cathéter implanté dans la colonne vertébrale lombaire d’un modèle de rat. Le composé circule le long du LCR jusqu’au cerveau et à la moelle épinière, pénètre dans les neurones et offre un potentiel thérapeutique.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Chirurgie

1. Avec le rat soutenu par le tube conique de 50 ml, identifiez les deux fosses naturelles entre les muscles au-dessus du bassin (flèches sur la figure 1A). Avec une main tenant ces fosses, utilisez l’autre main pour appuyer doucement et sentir la colonne vertébrale de la direction caudale à rostrale et trouver la première indentation majeure entre les vertèbres, c’est-à-dire l’espace intervertébral entre les vertèbres sacrées 1 (S1) et lombaire 6 (L6) (Figure 1B).
2. Déplacer légèrement vers le rostral pour identifier l’indentation suivante, l’espace intervertébral entre les vertèbres lombaires 5 (L5) et L6 et le site d’injection (* sur la figure 1A). À l’aide d’un scalpel, faites une incision d’au plus 2 cm de long dans la peau le long de la ligne médiane du rostral à la caudale de sorte que le site d’injection soit au centre de l’incision (ligne pointillée sur la figure 1A).
3. Utilisez des ciseaux de dissection pour disséquer le tissu conjonctif afin de visualiser la couche musculaire. Ensuite, faites une incision de 1 cm dans la capsule musculaire immédiatement latérale à l’apophyse vertébrale dorsale de la vertèbre lombaire L6.
   REMARQUE : Les os de la vertèbre lombaire L6 peuvent être visualisés à ce stade.
4. Positionnez l’ensemble canule-aiguille de guidage près de la face antérieure de la 6e vertèbre lombaire et poussez-le dans l’espace intervertébral le long de la face antérieure de la 6e vertèbre de sorte que l’extrémité de l’aiguille pénètre dans le canal rachidien. Poussez la canule guide en place le long de l’aiguille et retirez l’aiguille 23-G, en ne laissant que la canule guide en place.
   REMARQUE : Il est utile d’utiliser une pince émoussée pour localiser l’apophyse dorsale de la vertèbre lombaire L6 avant d’insérer l’aiguille. En général, on peut voir du liquide céphalo-rachidien (LCR) pénétrer dans le moyeu de l’aiguille (ce liquide peut être teinté d’un soupçon de sang, mais cela n’indique pas qu’un mal a été causé ou que l’aiguille n’est pas placée correctement). Les auteurs n’ont pas observé une grande quantité de sang ou des saignements graves au cours de cette procédure. Si l’un ou l’autre se produit, il faut communiquer avec un vétérinaire pour déterminer le traitement approprié et si les animaux doivent être euthanasiés.
5. Insérez l’ensemble cathéter-fil dans la canule de guidage. Inclinez l’ensemble cathéter-fil à un angle d’environ 45° par rapport au canal rachidien et forcez l’extrémité à environ 0,3 cm dans le canal rachidien.
6. Retirez la canule de guidage en laissant le cathéter avec le fil du stylet en place. Retirez le fil du stylet à environ 2,5 cm de l’extrémité intrathécale du cathéter et avancez le cathéter dans le canal rachidien jusqu’à ce que la marque de 2 cm soit à l’entrée du canal (juste visible sous le muscle), comme illustré à la figure 2Bvi.
   REMARQUE : Le cathéter inséré doit s’étendre rostralement dans l’espace sous-arachnoïdien. Un placement réussi devrait permettre au cathéter de se déplacer librement dans cet espace.
7. Retirez complètement le fil du stylet et vous verrez peut-être du LCR pénétrer dans le cathéter implanté.
8. Connectez l’ensemble du cathéter d’administration à l’extrémité distale du cathéter implanté via l’extrémité de l’aiguille 30 G (Figure 2Bv, vi).
9. Chargez 60 μL de solution saline stérile dans une seringue de 100 μL (seringue de rinçage). Chargez un bolus de 30 μL du composé d’essai (p. ex., oligonucléotide antisens ou solution ASO) dans une deuxième seringue (seringue d’injection).
10. Connectez la seringue de rinçage (chargée de solution saline) à l’extrémité de l’adaptateur de tubulure de l’ensemble du cathéter de distribution (Figure 2Bv). Injecter 20 μL de solution saline stérile dans l’espace intrathécal (rinçage pré-injection).
11. Connectez la seringue d’injection (chargée avec le composé d’essai) à l’extrémité de l’adaptateur de tubulure du cathéter de distribution (Figure 2Bv). Injecter 30 μL de composé d’essai dans l’espace intrathécal pendant 30 s.
    REMARQUE : Le volume d’injection systématique d’ASO est de 30 μL pour obtenir une bonne inactivation de la moelle épinière et du cortex. Il a été signalé que les volumes d’injection peuvent avoir un impact sur la distribution du composé, bien que différents volumes d’injection n’aient pas été testés. Si un autre composé ou un autre volume est utilisé, l’innocuité et l’efficacité doivent être déterminées empiriquement.
12. Répétez l’étape 1.10 et rincez le cathéter avec 40 μL supplémentaires de solution saline stérile (rinçage post-injection). Détachez ensuite l’ensemble du cathéter d’administration du cathéter implanté.
    REMARQUE : On pense que le rinçage pré et post-injection réduit la séquestration locale des composés et améliore leur distribution aux structures rostrales.
13. Pour couper de manière aseptique et thermosceller le cathéter implanté, placez une paire de pinces à dissection stériles dans un stérilisateur à billes jusqu’à ce qu’elles soient très chaudes, puis fixez la tubulure avec l’extrémité chaude de la pince.
    REMARQUE : Cette action fait fondre le cathéter. Ainsi, le trou dans le tube s’effondre et tous les côtés se collent les uns aux autres, scellant le tube de manière aseptique. Ensuite, il est placé dans l’espace sous-cutané.
14. Utilisez des sutures monofilaments résorbables pour fixer le cathéter thermoscellé restant au tissu conjonctif. Ensuite, utilisez des sutures monofilaments non résorbables pour fermer la peau sur le cathéter thermoscellé sécurisé.
    REMARQUE : Les clips de plaie peuvent également être utilisés conformément au protocole du comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux (IACUC). La technique est compatible avec les injections répétées, bien qu’elle n’ait été utilisée que pour des injections uniques dans nos mains. La faisabilité des injections répétées doit être évaluée empiriquement avec l’approbation de l’IACUC.
15. Utilisez de la gaze et du sérum physiologique pour laver le sang de la peau et laissez l’animal se remettre de l’anesthésie dans un incubateur chauffé jusqu’à ce qu’il soit mobile, après quoi il est renvoyé dans sa cage d’origine (deux rats par cage).
    REMARQUE : Lorsque vous effectuez des interventions chirurgicales sur plusieurs rats le même jour, nettoyez les outils avec de l’eau pour enlever le sang et stérilisez-les à nouveau à l’aide d’un stérilisateur à billes sèches chauffé (pendant au moins 20 s, avec le temps de refroidir) entre animaux. Un nouvel ensemble d’instruments est utilisé pour tous les 5 animaux.
16. Surveillez les animaux quotidiennement pendant au moins 3 jours après l’opération et continuez à les surveiller chaque semaine après l’opération, selon le protocole de l’IACUC.

Résultats

Figure 1 : Identification du site d’injection et de la ligne d’incision. (A) Avec l’abdomen du rat soutenu par un tube conique de 50 ml, les deux fosses entre les muscles au-dessus du bassin sont facilement visibles (flèches). (B) Avec une main...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Tube PE intramédical BD	Tube en polyéthylène PE50, diamètre 0.023 en	BD 427400 (10 ft, Fischer Scientific 22-204008) ou 427401 (100 ft, Fischer Scientific 14-170-12P)
Tube PE intramédical	BD	Tube en polyéthylène PE10, diamètre 0,011 po	BD 427410 (10 pi, Fischer Scientific 14-170-11B) ou 4274011 (100 pi, Fischer Scientific 14-170-12B)
Aiguilles à usage unique BD PrecisionGlide 30G	BD		BD
Canule de guidage	BD	19G x 1 WT (1,1 mm x 25 mm) aiguille	BD 305186
seringue Hamilton 100 ul	Hamilton company	Seringue Hamilton 100 ul
Stérilisateur à billes chaudes Fine	Science Tools		Stérilisateur modèle no. FST 250
Gommage à la povidone	PDI		S48050
Saline	Baxter	Chlorure de sodium perfusion intraveineuse à 0,9 % BP 50 ml	FE1306G
Scalpel	Feather	Scalpel jetable	n° 10
Coussin chauffant pour petits animaux	K&H Manufacturing		No. 1060
Stylet wire	McMaster-Carr	1749T14	LH-36233780
Drap d’essuie-mains chirurgicaux	Dynarex		4410
Ciseaux chirurgicaux et pinces	FST et sutures Fisher Scientific
	Ethicon		4-0 ou 5-0
Source alternative de matériaux préfabriqués et stérilisés pour cette procédure
Cathéter doseur système	SAI Systèmes		RIDC-01
Canule de guidage	Systèmes		SAI RIDC-GCA
Cathéters internes	Systèmes		SAI RIDC-INC
Fil stylet	Systèmes de perfusion		SAI RIDC-STY

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